ELISA檢測試劑盒可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標記的抗原或抗體，③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。
(一)雙抗體夾心法
雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法，操作步驟如下：
(1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
(2)加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
(3)加酶標抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
(4)加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量。
根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。
(二)雙位點一步法
在雙抗體夾心法測定抗原時，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步(圖15-5)。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應(yīng)時間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA檢測試劑盒提高到新水平。
在一步法測定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)(hookeffect)，類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實際含量。鉤狀效應(yīng)嚴重時甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
(三)間接法測抗體
間接法是檢測抗體zui常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。
(1)將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
(2)加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。
(3)加酶標抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。ELISA檢測試劑盒例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。
(4)加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。
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