HRP分子中與酶活性無關(guān)的糖基被過碘酸鈉氧化為醛基，再與抗體蛋白的氨基形成Schiff堿。為了防止酶蛋白的氨基與醛基發(fā)生自身偶聯(lián)，在標記前先用2，4-二硝基氟苯（DNFB）封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基。酶與抗體的結(jié)合反應(yīng)后，再加入硼氫化鈉還原成穩(wěn)定的結(jié)合物。
（1） 取HRP 5mg溶于0.2mol/L，pH5.6醋酸鹽緩沖液1ml中，加入1%DNFB無水乙醇溶液0.1ml，室溫下輕微攪拌1h；
（2） 加入新鮮配置的0.1mol/L NaIO4 0.5ml，此時溶液由原棕色變?yōu)槟G色，置4℃放置30min，此時溶液由原棕色變?yōu)槟G色；
（3） 加入2.5%乙二醇1ml， 室溫下輕微攪拌1h，終止反應(yīng)；
（4） 加入待標記的抗體5-10mg， 用1.0mol/L， pH9.5 CBS，調(diào)節(jié)pH值至9.0；
（5） 混勻，置4℃過夜
（6） 加入硼氫化鈉溶液0.1ml，混勻，4℃放置3h；
（7） 對0.01mol/L，pH7.4 PBS，4℃透析過夜，換液3次；
（8） 3000r/min離心30min，去除沉淀物；
（9） 收集上清液即為酶標記抗體。
【注意事項】
（1） 在氧化HRP時，以pH5.6醋酸鹽緩沖液溶解酶為宜。
（2） 一般認為氧化HRP 5mg， NaIO4量以0.06mol/L 0.5ml為宜，不能低于0.015mol/L 0.5ml。
（3） 氧化HRP時間以15-30min為宜。
（4） 加入DNFB的目的是為了封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基。
（5） 加入乙二醇的目的是終止反應(yīng)；為便于在加入抗體后調(diào)pH值，故乙二醇要用0.05mol/L CBS配制。
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